如何實現bigwig歸一化

小編給大家分享一下如何實現bigwig歸一化，相信大部分人都還不怎么了解，因此分享這篇文章給大家參考一下，希望大家閱讀完這篇文章后大有收獲，下面讓我們一起去了解一下吧！

在chip_seq數據展示時，經常會用到bigwig文件，導入igvtools等基因組瀏覽器中，產生如下所示的圖片

我們將IP樣本相對Input樣本中reads富集的區域定義為peak, 反映到上圖中，則對應的為IP樣本中reads出現了峰值，比如下圖紅色標記的區域

通過這種可視化的方式，可以直觀的反映出peak區域的情況，但是在實際使用中需要注意歸一化的問題。

bigwig文件本質上展示的是測序深度的分布信息，而原始的測序深度是和測序的reads量呈正相關關系的，比如Input樣本測序5G, IP樣本測序10G, 在原始的測序深度看，會看到Input樣本相比IP樣本，其測序深度是偏高的。當然這個是一個極端的例子，但是很好的說明了測序量的差異對原始的測序深度會有直接的影響。

為了消除樣本間測序數據量差異的影響，很當然的我們想到了歸一化，類似轉錄組中的定量策略，原始的測序深度就是raw count, 那么當然類似RPKM, CPM等歸一化方式，對于bigwig文件而言，同樣適用。

在deeptools中，提供了多種歸一化方式

1. RPKM

RPKM的公式如下

RPKM (per bin) = number of reads per bin / (number of mapped reads (in millions) * bin length (kb))

用法如下

deeptools bamCoverage \
-p 10 \
--bam input.bam \
--normalizeUsing  RPKM \
--outFileName rpkm.bigwig

2. CPM

CPM的公式如下

CPM (per bin) = number of reads per bin / number of mapped reads (in millions)

用法如下

deeptools bamCoverage \
-p 10 \
--bam input.bam \
--normalizeUsing  CPM \
--outFileName cpm.bigwig

3. BPM

BPM的公式如下

BPM (per bin) = number of reads per bin / sum of all reads per bin (in millions)

用法如下

deeptools bamCoverage \
-p 10 \
--bam input.bam \
--normalizeUsing  BPM \
--outFileName bpm.bigwig

4. RPGC

RPGC的公式如下

RPGC (per bin) = number of reads per bin / scaling factor for 1x average coverage
scaling factor =  (total number of mapped reads * fragment length) / effective genome size

用法如下

deeptools bamCoverage \
-p 10 \
--bam input.bam \
--normalizeUsing  RPGC \
--effectiveGenomeSize 2864785220 \
--outFileName rpgc.bigwig

對于同一個樣本而言，導入igvtools中，幾種歸一化方式產生的bigwig文件和原始的bigwig文件的峰形是完全一樣的 ，示意如下

注意紅色方框標記的縱軸的范圍，可以看到不同方式，其縱軸范圍不一樣。

歸一化主要用于樣本間的比較， 比如在比較Input和Ip兩個樣本時，就應該使用歸一化之后的數據，以RPKM為例，導入之后可以看到如下所示的結果

可以看到縱軸的范圍是不一致的，為了更好的比較樣本間的差異，我們需要把二者的縱軸范圍調整成一致的，因為數據已經做了歸一化處理，所以可以直接在同一范圍內進行比較，設置成同一范圍后，效果如下

對于上述多種歸一化方式，其實都是可以拿來在樣本間比較的。在實際操作中，由于RPKM的概念最為經典，應用的也最為廣泛。

以上是“如何實現bigwig歸一化”這篇文章的所有內容，感謝各位的閱讀！相信大家都有了一定的了解，希望分享的內容對大家有所幫助，如果還想學習更多知識，歡迎關注億速云行業資訊頻道！