htseq-count中怎么實現定量分析操作

htseq-count中怎么實現定量分析操作，很多新手對此不是很清楚，為了幫助大家解決這個難題，下面小編將為大家詳細講解，有這方面需求的人可以來學習下，希望你能有所收獲。

和featurecounts一樣，htseq-count也是一款進行raw count定量的軟件。該軟件采用python語言進行開發，集成在HTseq這個包中。

對于python的包，通過pip可以方便的進行安裝，代碼如下

pip install HTSeq

HTSeq提供了許多處理NGS數據的功能，htseq-count只是其中進行定量分析的一個模塊。

htseq-count的設計思想和featurecounts非常類似，也包含了feature和meta-features兩個概念。對于轉錄組數據而言，feature指的是exon, 而meta-feature可以是gene, 也可以是transcript。

進行定量分析需要以下兩個文件

1. 比對的BAM/SAM文件

2. 基因組的GTF文件

   
   

對于雙端數據，要求輸入sort之后的BAM文件。

由于序列讀長的限制和基因組的同源性，一條reads可能比對到多個基因上，而且基因之間也存在overlap, 在對這些特殊情況進行處理時，htseq-count內置了以下3種模式

1. union

2. intersection-strict

3. intersection-nonempty

   
   

通過--mode參數指定某種模式，默認值為union。這3種模式在判斷一條reads是否屬于某個feature時，有不同的判別標準，示意圖如下

在BAM文件，包含了比對上的reads和沒有比對上的reads, 只有比對上的reads 會用來計數，htseq-count默認會根據mapping的質量值對BAM文件進行過濾，默認值為10, 意味著只有mapping quality > 10的reads才會用來計數，當然可以通過-a參數來修改這個閾值。

能夠明確reads屬于一個featurer時，比如示意圖種的第一種情況，reads完全是gene_A的一個片段，該feature的計數就加1；能明確reads不屬于一個feature時，稱之為no_feature, 比如示意圖種的第二種情況，reads的一部分比對上了gene_A, 在intersection_strict模式下，判定該reads不屬于gene_A, 就是no_feature。

當不明確一條reads是否屬于某個feature時，通常是由于reads在兩個gene的overlap區，比如示意圖中的第六和第七種情況，這樣的reads被標記為ambigous。

當一條reads比對上了兩個feature時，會被標記為alignment_not_unique。

在統計屬于某個基因的reads數時，需要重點關注對 ambiguous 和 alignment_not_unique 的reads的處理， 通過--nonunique參數來指定，取值有以下兩種

1. none

2. all

   
   

默認值為none時，這兩種reads被忽略掉，不進行任何的計數；取值為all時，對應的所有feature的計數都會加1。

除了--mode和--nonunique兩個參數外，還需要關注--stranded參數，這個參數指定文庫的類型，默認值為yes, 代表文庫為鏈特異性文庫，no代表為非鏈特異性文庫。對于非鏈特異性文庫文庫，在判斷一條reads是否屬于一個基因時，只需要關注比對位置，而鏈特異性文庫還需要關注比對的正負鏈和基因的正負鏈是否一致，只有一致時，才會計數。

理解了以上3個參數，就能夠正確的使用htseq-count了。對于非鏈特異性的數據，常規用法如下

htseq-count \
-f bam \
-r name \
-s no \
-a 10 \
-t exon \
-i gene_id \
-m union \
--nonunique=none \
-o htseq.count \
align.sorted.bam \
hg19.gtf

在運行速度上，featurecounts比htseq-count快很多倍，而且feature-count不僅支持基因/轉錄本的定量，也支持exon等單個feature的定量。所以更加推薦使用featurecounts來定量。

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